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環(huán)境因素

1．無(wú)菌環(huán)境

無(wú)毒和無(wú)菌是體外培養(yǎng)細(xì)胞的首要條件。細(xì)胞在活體內(nèi)，解毒系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)可抵抗微生物或其他有害物質(zhì)的入侵，但細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，缺乏機(jī)體免疫系統(tǒng)的保護(hù)而喪失對(duì)微生物的防御能力和對(duì)有害物質(zhì)的解毒能力。為保證細(xì)胞能在體外環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，必須要確保無(wú)菌工作區(qū)域、良好的個(gè)人衛(wèi)生、無(wú)菌試劑和培養(yǎng)基以及無(wú)菌操作。

常見(jiàn)的微生物污染有支原體、細(xì)菌、真菌。支原體無(wú)致死毒性，可與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，對(duì)細(xì)胞有潛在影響，但體積小，不易鑒別，可借助于地衣紅或Hoechst33342染色來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)菌增殖快，在短時(shí)間內(nèi)即可大量擴(kuò)增，并產(chǎn)生毒素殺死細(xì)胞。真菌的種類(lèi)繁多，肉眼可見(jiàn)，漂浮于培養(yǎng)液面上，可呈絲狀、管狀或樹(shù)枝狀等。

2.合適的溫度

一般哺乳類(lèi)與禽類(lèi)細(xì)胞在體外培養(yǎng)的適宜溫度是37～38℃，不適宜的環(huán)境溫度會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞對(duì)低溫的耐受能力要強(qiáng)于對(duì)高溫的耐受能力，在低溫下，細(xì)胞的代謝活力及核分裂能力降低。若溫度不低于0℃，雖然細(xì)胞代謝受到影響，但無(wú)損傷作用；25～35℃時(shí)，細(xì)胞以緩慢的速度生長(zhǎng)；但若被置于40℃數(shù)小時(shí)，則不僅不利于細(xì)胞生存、生長(zhǎng)，甚至可導(dǎo)致其死亡。

3.適宜的滲透壓

高滲溶液或低滲溶液會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生褶皺、腫脹、破裂。因此，滲透壓是體外培養(yǎng)細(xì)胞的重要條件之一。多數(shù)體外培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)滲透壓都有一定的耐受能力，實(shí)際應(yīng)用中，260～320mmol/L的滲透壓可適用于大多數(shù)細(xì)胞。

4．氣體環(huán)境與pH

細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要理想的氣體環(huán)境，氧氣、二氧化碳是細(xì)胞生存的必要條件。氧氣參與細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞生存、代謝與合成提供能量；二氧化碳既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，是細(xì)胞生長(zhǎng)的必需成分，又與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。大多數(shù)細(xì)胞適宜的pH范圍往往是7.2～7.4。在開(kāi)放式培養(yǎng)中，以5%的二氧化碳?xì)怏w比例為宜。

營(yíng)養(yǎng)條件

1．培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)基包含細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素等。針對(duì)不同細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，有多種合成培養(yǎng)基可供選擇，如EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM等。

2．其他添加成分

在各種合成培養(yǎng)基提供基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之外，還需根據(jù)不同細(xì)胞和不同的培養(yǎng)目的添加其他成分，如血清、因子等。

血清提供的是細(xì)胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白等重要物質(zhì)，常用的是胎牛血清。要根據(jù)不同的細(xì)胞和不同的研究目的決定添加血清的比例。10%～20%的血清能維持細(xì)胞較快的生長(zhǎng)增殖速度，稱(chēng)為生長(zhǎng)培養(yǎng)液；為維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或不死，添加2%～5%的血清即可，稱(chēng)為維持培養(yǎng)液。但血清中也存在有害于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì)，如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長(zhǎng)抑制因子；成分不明確，影響對(duì)結(jié)果的分析；不同動(dòng)物、不同批次的血清活性差別較大，影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性。

谷氨酰胺是細(xì)胞生長(zhǎng)重要的氮源，在細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過(guò)程中起重要作用，但由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，故谷氨酰胺需在使用前添加。